疏水作用層析 (HIC) 是在蛋白天然的狀態下用于分離純化蛋白使用最為廣泛的方法。HIC也被證明是非常有用的工具在分離蛋白復合物和研究

蛋白折疊和解折疊。因此，HIC如何發揮作用? 在技術后面的原理是什么? 去理解在這類色譜后面的原理，如下幾點你肯定需要了解。

HIC如何發揮作用?

      簡言之，HIC (也叫鹽析)使用疏水性的特點來分離蛋白. 在這個方法操作中，包含親水和疏水區域的蛋白在高鹽緩沖液條件下加入到HIC柱子

中。緩沖液中的鹽 (通常是硫酸銨)降低了樣本溶質的溶解 從而暴露出了蛋白分子表面的疏水區域。這協助這些疏水區域到柱子固相支撐物疏水區域

的吸附，最終使溶液中的蛋白沉淀（結晶）出來.請記住當進行這種類型的色譜時, 加入的感膠離子鹽增強了疏水效果同時降低了單獨疏水區域數量

和體積。當降低鹽濃度會導致從固相支持物上的解吸附. 以此類推，樣品的洗脫可以通過降低鹽的濃度來實現。溫和的有機溶液修飾劑或去污劑或

許也可以加到洗脫液中來協助洗脫的過程。使用HIC的原理, 你可以從水溶液中在各種程度下結合蛋白，結合程度取決于目標蛋白的結構，鹽濃度，

PH值，溫度和使用的有機溶劑。

疏水作用層析: 揭示潛在的理論 

      有三種主要的理論能夠幫助解釋在HIC背后的機理 – (1) 鹽析理論 (2) 熱動力學理論以及 (3)表面張力或范德華力理論.

鹽析理論

       根據鹽析理論, 這些疏水氨基酸行成被保護的疏水區域一旦在水溶液中發生折疊然而親水性氨基酸允許蛋白去和水中的氫鍵發生結合。 結果是

溶解在水中的蛋白會增加如果有足夠的親水區域存在于蛋白分子表面.

       然而，一旦在溶液中加入抗離液劑鹽 (比如硫酸銨和硫酸鈉), 一些水分子將會和鹽離子發生作用而不是和蛋白質的電荷部分. 當溶液中蛋白和

蛋白的相互作用比溶劑溶質的相互作用更加強的話, 蛋白分子會和另外一個蛋白分子自由發生相互作用 – 從而使他們發生集結最終從溶液中沉淀出

來。因此，溶液中鹽的加入在不同程度上降低了不同蛋白的溶解性。

熱動力學理論 

      這個理論說明疏水分子之間的相互作用是一個熵驅動的過程，基于熱動力學第二定律。在一種極性溶劑中兩個或多個非極性分子之間的疏水作

用是一種熵變化的自發過程。然而，這種作用可以通過控制溫度或修改溶劑的極性來發生改變。

     因此，當一種非極性的分子和一種極性的溶劑比如說水接觸的時候,圍繞著疏水性分子的溶劑分子會有一定程度的增加。只要焓不顯著增加，這

會導致熵的降低同時會給吉布斯能一個正向的變化。 同樣，非極性分子溶解到極性溶劑中不會發生自發的反應因為這不是熱動力學傾向性的.

     然而，當你將兩種或更多種非極性分子放到一個極性的環境中, 大分子的疏水表面會從極性環境中隱藏起來，同時疏水分子會自發的發生聚集。

這種高度結構性的溶劑分子周邊被暴露出來的疏水分子的表面所環繞將會被包含少量結構分子的大量溶劑所替換。造成的結果是，熵增加同時吉布

斯能降低。在這種情況下，疏水作用變成一種熱動力學傾向性的過程。

表面張力，范德華力理論

     這種理論認為在HIC中的疏水作用是取決于蛋白和固定的配基之間的范德華力因為在鹽析鹽的存在下，隨著水的有序結構的增加這些力會增加