二代測序近年來飛速發展，做過文庫構建的小主們，是不是曾經深受文庫產量低、質量差、測序數據不好這些問題的困擾？如何一步步排查問題，找到癥結并優化呢？

別著急，小編在這里為大家整理了NGS文庫構建中的連接模塊正確測評方法及連接效率的影響因素，看完以后大家就對接頭連接有全局的把握，排除連接模塊對文庫的影響更是不在話下！

說到接頭連接，就得從文庫制備的概念說起了……

文庫制備（Library Preparation）就是在DNA片段兩端連上特定序列的接頭（兩側的序列不同）的過程。

在連接接頭過程中，不是所有的DNA片段都能兩端接上接頭，接頭連接效率的概念在這里就要引入了。接頭連接效率是指在DNA片段兩端均加上測序接頭的DNA量占起始總DNA量的比值。它是影響文庫產量的重要指標之一，對文庫的質量和產量具有重要的影響。若連接效率低，那么未連上接頭的DNA片段無法得到PCR擴增；連接效率越高，代表文庫轉化率越高，可以說，接頭連接效率直接影響最終的文庫復雜度和有效測序數據。

接頭連接效率這么重要，要如何對連接效率進行正確的測評呢？

1.一般連接效率的評測方法

方法一：對比連接前后文庫的量。

指的是測定接頭連接前的文庫量，然后進行接頭連接，純化后測定剩余的文庫量。這類方法被很多人使用，實際上卻存在很大的問題。通常連接后文庫中，會存在接頭、未連接接頭片段或者單端連接接頭的文庫，通過Qubit熒光定量，只能確定總的雙鏈DNA量，無法確定有效的雙端連接接頭文庫的量。因此此方法會與實際結果存在巨大誤差。并且磁珠的純化也有一定的文庫損失，具體效率無法準確把控。

方法二：更換連接模塊做平行測試。

指的是通過更換不同的連接模塊，對比最終文庫產量，來評測不同連接模塊的連接效率高低。同樣，這類方法也存在一些弊端，首先這種方法無法排除不同連接模塊與原體系的兼容性對產量的影響，其次這種方法只能間接的反映哪種連接模塊更有優勢，無法評測具體連接模塊的連接效率。

總結：

以上兩種接頭連接的測評方法其實都犯了一類錯誤：將關注點放在文庫的產量上面而不是具體連接上接頭片段的比例。這是因為接頭的連接不僅要看接頭連接的文庫的產量，更要看連接文庫的效果，而后者才是評估連接效率的關鍵因素。

方法一：Agilent 2100檢測連接峰圖法

小編對此做了測試，對已知片段大小的DNA片段（350bp）進行接頭連接，文庫在連接接頭后進行Agilent 2100檢測，結果表明，雖然文庫連接上了接頭，但是只有兩端均連接上了接頭的文庫才能被擴增和測序。當未連接或單端連接接頭的含量很少時，或者雙端連接接頭的文庫含量高時，代表接頭連接的效率越高。

方法二：qPCR定量法

qPCR法定量文庫的方法是以qPCR為基礎，通過標準曲線的校準，精確定量文庫中用于雙端完整接頭的文庫數量。因為此方法使用的引物為通用序列，若只有一端連接接頭或未連接接頭的文庫是無法得到擴增，也就是無法檢測到熒光值，最終濃度是將這部分文庫排除。此方法可以精準的測定文庫中成功連接接頭的文庫數量，以此可以精準的評測連接的效率情況。

 重慶華雅思創生物醫藥科技有限公司主營：生物技術產品的銷售與技術服務、生物新技術新產品展示、生命科學領域項目合作服務、品牌策劃與品牌形象廣告宣傳、生物醫藥行業人才咨詢服務、生物醫藥行業管理咨詢服務。以“傳遞科學價值，服務科學研究”為宗旨，重慶華雅思創生物醫藥科技有限公司在全中國代理的干細胞產品已經成功銷往：上海市、北京市、重慶市、天津市、廣東省的廣州市、深圳市、珠海市、江西省的南昌市、四川省的成都市、綿陽、浙江省的杭州市、寧波、溫州、江蘇省的南京市、蘇州、無錫、泰州、湖南省的長沙、陜西省的西安市、楊凌、甘肅省的蘭州、寧夏的銀川、新疆的烏魯木齊、廣西省的南寧市、山東省的濟南、青島、東北三省 遼寧省的沈陽市、大連市、吉林省的長春市、黑龍江省的哈爾濱市、海南省三亞等中國絕大部分省市和自治區。

 熱賣產品：